Театр відкрився в Харкові 1 липня 1939 року. Перший художній керівник — Струменко Олександр Миколайович. Саме його п'єсою «На волі» відкрився перший театральний сезон 18 серпня 1939 року. Театр фактично не мав стаціонарного приміщення.

21 вересня 1941 року (під час ІІ Світової війни) театр був евакуйований до міста Червоний Кут Саратовської області. Від грудня 1941 року заклад перебував на евакуації у місті Талас (тоді Фрунзенської області), Киргизстан. Від січня 1942 року по кінець березня 1944 року відбувалися театральні виступи. Репертуар у цей час становив 19 п'єс. О. Струменко створив ляльково-концертну програму «Петрушка і фашист», що миттєво завоювала популярність.

У квітні 1944 року театр повернувся до Харкова, де фактично працював як пересувний. 1946 року до творчого колективу долучилися Г. Стефанов, Л. Гнатченко, П. Янчуков, 1948-го — М. Корик, Т. Фоміна, В. Кузьміна, концертмейстер А. Уралова (у майбутньому провідні актори трупи).

У 1952 році художнім керівником театру став В.А. Афанасьєв. У травні цього ж року Харківському театрові ляльок було надане приміщення по вулиці Красина, 3, де знаходився обласний будинок народної творчості. Незабаром приміщення цілком передали театрові. Відтоді починається розквіт Харківського лялькового театру.

Від 2-ї половини 1950-х років театр став одним із найпопулярніших у місті, в Україні, і загалом в СРСР, гідним творчим суперником найвідомішого у світі Московського театру ляльок під керівництвом С. Образцова.

У 1955 році відбулася перша в Україні прем'єра постановки для дорослого глядача — «Чортів млин» І. Штока (режисер В. Афанасьєв, художники А. Щеглов та Е. Гуменюк, композитор Н. Богословський). Ця вистава унікальна не тільки як перша постановка для дорослих в Україні, але і як довгожитель у ляльковому середовищі. Вона пережила вже 2 реставрації з моменту своєї появи, і майже 50 років не сходить зі сцени, користуючись незмінним успіхом у глядача.

19 травня 1956 року Віктору Андрійовичу Афанасьєву присвоєно звання заслуженого діяча мистецтв УРСР. В. Афанасьєв обирається президентом Української секції UNIMA (Міжнародного союзу діячів театру ляльок), потім віце-президентом Радянської секції UNIMA. 15 квітня 1967 року Віктору Афанасьєву присвоєно звання Народного артиста УРСР.

23 серпня 1968 року театр відкриває сезон у новому приміщенні на площі Тевелєва (нині площа Конституції), 24, де розташований й дотепер.

1969 року народний артист України Віктор Афанасьєв створив і очолив при Харківському інституті мистецтв першу і донині єдину в Україні кафедру акторів і режисерів театру ляльок.

Новий підйом творчого життя Харківського театру ляльок був пов'язаний з приходом 1991 року на посаду головного режисера заслуженого діяча мистецтв України Євгена Юзефовича Гімельфарба.

6 листопада 1997 року театру присвоєно ім'я Віктора Андрійовича Афанасьєва.

На підставі Наказу Міністерства культури і мистецтв України від 30 жовтня 2002 року № 625 про присвоєння театру статусу «Академічний», театр перейменовано у Харківський державний академічний театр ляльок ім. В.А. Афанасьєва.

Заслуги театру в розвитку вітчизняного театрального мистецтва відзначалися нагородами акторів: звання заслужених артистів України одержали П. Янчуков, Г. Стефанов, Л. Гнатченко, Ф. Грошева, О. Рубинський, В. Бардуков, В. Горбунов.